TEKNIK STERILISASI KULTUR JARINGAN PADA TANAMAN
JATI (Tectona grandis)1
1. Latar
Belakang
Beberapa
kelebihan dari penggunaan teknik kultur jaringan
dibandingkan
dengan cara konvensional adalah (1) faktor
perbanyakan
tinggi, (2) tidak tergantung pada musim karena
lingkungan
tumbuh in-vitro terkendali, (3) bahan tanaman yang
digunakan
sedikit sehingga tidak merusak pohon induk, (4)
tanaman yang
dihasilkan bebas dari penyakit meskipun dari induk
yang mengandung
patogen internal, (5) tidak membutuhkan
tempat yang
sangat luas untuk menghasilkan tanaman dalam
jumlah banyak.
Sedangkan masalah yang banyak dihadapi dalam
mengaplikasikan
teknik kultur jaringan, khususnya di Indonesia
adalah modal
investasi awal yang cukup besar dan sumber daya
manusia yang
menguasai dan terampil dalam bidang kultur
jaringan tanaman
masih terbatas. Masalah lain yang sering muncul
adalah tanaman
hasil kultur jaringan sering berbeda dengan
tanaman induknya
atau mengalami mutasi. Hal ini dapat terjadi
karena
penggunaan metode perbanyakan yang salah, seperti
frekuensi
subkultur yang terlalu tinggi, perbanyakan melalui
organogenesis
yang tidak langsung (melalui fase kalus) atau
konsentrasi zat
pengatur tumbuh yang digunakan terlalu tinggi
(Mariska et al.,
1992).
.Salah satu
gangguan yang
sering terjadi dalam pelaksanaan kultur jaringan
biasanya berasal
dari individu tumbuhan atau eksplan yang
digunakan.
Misalnya, tumbuhan berasal dari alam/lapangan,
kondisi tumbuhan
yang terserang penyakit, dan bahan yang
tersedia
terbatas (Darmono, 2003).
1.2. Tujuan
Percobaan ini
bertujuan untuk mengetahui pengaruh sterilan
terhadap eksplan
tunas aksiler tanaman jati (Tectona grandis)
dalam kultur in
vitro.
B. METODE PENELITIAN
1. Bahan dan
Alat
a. Bahan
Media
Media yang
digunakan dalam penelitian ini adalah media
MS lengkap
(Murashige dan Skoog) dengan penambahan
NAA 100 ppm.
Eksplan
Eksplan yang
digunakan adalah tunas aksiler tanaman jati
(Tectona
grandis L.f) dari area tanam di Laboratorium
Kultur Jaringan
BBPBPTH, Kaliurang, Yogyakarta.
Bahan Sterilisasi
Sterilan yang
digunakan adalah etanol 70%, etanol 90%,
Sublimat/HgCl2
1%, bayclin/clorox 2%, dan aquades steril.
b. Alat-alat
Alat-alat yang
digunakan meliputi botol kultur, alumunium foil,
Petri dish, pembakar
spiritus, pisau, scalpel, pinset,
erlenmayer,
pipet, pHmeter, autoklaf, neraca analitik,
magnetic sterer, laminar air
flow cabinet, oven (microwave),
sprayer, dan
ruang kultur.
2. Prosedur
Penelitian
a. Sterilisasi
Sterilisasi Lingkungan Kerja
57
Sebelum
digunakan, laminar air flow cabinet disterilkan
dengan
menggunakan hand sprayer berisi alkohol 70%.
Setelah itu
lampu UV dinyalakan selama 1-2 jam (selama
lampu UV
menyala, kabin laminair air flow harus ditutup
rapat).
Sterilisasi Alat-alat dan Medium Kultur
Alat-alat dissecting-set
dan glass ware yang akan
digunakan,
dicuci dan dikeringkan kemudian dibungkus
dengan aluminium
foil dan disterilisasi di dalam autoklaf
dengan suhu
121°C, selama 60 menit. Sedangkan botol
kultur yang
telah berisi medium disterilisasi di dalam
autoklaf selama
20 menit.
Sterilisasi eksplan
Eksplan yang
berasal dari lapangan dicuci bersih dengan
air mengalir.
Kemudian eksplan dicuci dengan larutan
fungisida
sembari digosok permukaannya dengan spon.
Setelah itu
eksplan direndam dalam beaker glass yang
berisi larutan
fungisida dan digojog di atas magnetic sterer
selama sepuluh
menit. Kemudian dilakukan pembilasan
dengan air
mengalir selama tiga menit. Selanjutnya
eksplan direndam
dalam larutan detergen dan digojog di
atas magnetic
sterer selama sepuluh menit lalu dibilas
kembali dengan
air mengalir. Proses pencucian tersebut
dilakukan di
luar laminar air flow.
Selanjutnya,
dilakukan sterilisasi pada eksplan
menggunakan
bahan sterilan di dalam laminar air flow
cabinet dengan perlakuan
sebagai berikut:
1. Tunas aksiler
jati dibilas dengan aquades steril satu
kali. Kemudian
direndam dalam larutan bayclin/clorox
2% selama 5 menit,
lalu dibilas dengan air steril satu
kali. Terakhir,
tunas aksiler direndam dalam larutan
etanol 70%
selama 5 menit, lalu dibilas dengan
aquades steril.
2. Tunas aksiler
jati dibilas dengan aquades steril satu
kali. Kemudian
direndam dalam larutan sublimat 1%
selama 5 menit,
lalu dibilas dengan aquades steril
satu kali.
Terakhir,tunas aksiler direndam dalam
58
larutan etanol
70% selama 5 menit menit, lalu dibilas
dengan aquades
steril.
b. Pembuatan
Medium
Medium yang
digunakan dalam penelitian ini adalah medium
MS lengkap
(Murashige dan Skoog) dengan penambahan
ZPT. Langkah
awal adalah dengan pembuatan larutan induk
(stok) yang
terdiri dari larutan stok makro, larutan stok mikro,
larutan vitamin
dan larutan stok Fe-EDTA. Pembuatan larutan
stok bertujuan
untuk mengefisiensi waktu pembuatan medium,
terutama dalam
penimbangan atau penghitungan komponen
yang akan
digunakan.
Adapun tahapan
dalam pembuatan medium MS lengkap
dalam satu liter
air adalah sebagai berikut :
1. Menyiapkan
aquades 500 ml dalam beaker glass volume
1000 ml.
2. Menambahkan
larutan stok yang sudah disiapkan ke
dalam beaker
galss. Terdiri dari larutan A (stok makro)
sebanyak 20 ml,
larutan B (stok mikro) sebanyak 20 ml,
larutan C
sebanyak 5 ml, larutan D sebanyak 5 ml, vitamin
sebanyak 5 ml. Beaker
glass yang telah berisi campuran
larutan tersebut
selanjutnya diaduk dengan menggunakan
magnetic sterer.
3. Menimbang dan
memasukkan 20 gram gula pasir.
4. Menambahkan
aquades hingga volume larutan mendekati
1000 ml.
Kemudian mengukur pH pada kisaran 5.6-5,8
jika terlalu
asam ditambah NaOH dan bila terlalu basa
ditambah HCl.
5. Menambahkan
ZPT yaitu NAA 100 ppm sebanyak 1 ml.
6. Menimbang dan
memasukankan agar-agar sebanyak 12
gram. Setelah
tercampur, beaker glass berisi medium
dipanaskan di
dalam oven selam 6 menit kemudian
didinginkan
selama 4 menit di atas magnetic sterer.
7. Menuangkan
medium ke dalam botol kultur sebanyak ± 20
ml, kemudian di
tutup dengan aluminium foil.
8. Tahapan
terakhir adalah mensterilkan medium dalam
autoklaf dengan
suhu 121°C, selama 30 menit. Lalu,
medium
didinginkan dan disimpan dalam ruang inkubasi.
59
Medium dapat
digunakan minimal setelah 3 hari untuk
mengetahui ada
tidaknya kontaminansi.
c. Inokulasi Dan
Inkubasi
Penanaman/Inokulasi
eksplan dilakukan di dalam laminar air
flow cabinet. Eksplan yang
telah disteriliasi dipindahkan ke
dalam cawan
Petri. Kemudian, dikuliti permukaannya dengan
menggunakan
scalpel. Setelah itu, tunas dipotong dengan
panjang ± 2-3 cm
dan eksplan diinokulasikan pada medium.
Selanjutnya
botol medium ditutup dengan aluminium foil dan
diinkubasi di
ruang kultur selama 3 minggu.
d. Pengamatan
Pengamatan
dilakukan pada seluruh eksplan yang ditanam
dalam setiap
satuan perlakukan, meliputi :
a. Kecepatan
kontaminasi eksplan
b. Jumlah eksplan
terkontaminasi
C. HASIL DAN
PEMBAHASAN
1. HASIL
Tunas aksiler
jati yang telah disterilisasi menunjukkan hasil yang
berbeda pada
kecepatan kontaminasinya. Pengamatan yang
dilakukan secara
deskriptif setiap hari (kecuali sabtu dan minggu)
menunjukkan bahwa
eksplan yang disterilisasi menggunakan
clorox 2 % lebih
cepat terkontaminasi dibandingkan eksplan yang
disterilkan
menggunakan sublimat. Kontaminasi eksplan dengan
perlakuan clorox
tampak pada hari setelah tanam (HST) 1 dimana
2 dari 20
eksplan terkontaminasi. Sedangkan kontaminasi eksplan
dengan perlakuan
sublimat tampak pada hari setelah tanam (HST)
3 dan hanya satu
eksplan yang terkontaminasi. Minggu pertama
menunjukkan
total eksplan kontam pada perlakuan clorox adalah 6
eksplan
sedangkan perlakuan sublimat 2 eksplan.
60
HST (Minggu
Pertama)
Eksplan Kontam
Sublimat
Clorox
HST (Minggu
Kedua)
Eksplan Kontam
Sublimat
Clorox
Pengamatan
kontaminasi pada minggu kedua dan ketiga
menunjukkan
bahwa jumlah eksplan kontam lebih banyak terjadi
pada eksplan
yang diperlakukan dengan clorox daripada perlakuan
dengan sublimat.
Pada minggu kedua hanya ada 6 eksplan bebas
kontaminan dari
14 eksplan tersisa yang diperlakukan dengan
clorox.
Sedangkan eksplan yang diperlakukan dengan sublimat
menyisakan 12
eksplan bebas kontam dari 18 eksplan yang tersisa.
61
Minggu ketigapun
masih terjadi kontaminasi eksplan pada kedua
perlakuan dimana
jumlah eksplan yang terkontaminasi pada
perlakuan clorox
sebanyak 4 eksplan dan 6 eksplan pada
perlakuan
sublimat.
HST (Minggu Ketiga)
Eksplan Kontam
Sublimat
Clorox
Pengamatan
minggu terakhir (minggu keempat) tidak
menunjukkan
adanya kontaminasi eksplan, baik pada perlakuan
clorox maupun
pada perlakuan sublimat. Total eksplan kontam
pada perlakuan
clorox adalah sebanyak 18 eksplan dari 20
eksplan,
sedangkan total eksplan kontam pada perlakuan sublimat
berjumlah 14
eksplan dari 20 eksplan dengan kata lain hanya ada
2 eksplan bebas
kontaminan pada perlakuan clorox dan 6 eksplan
bebas kontaminan
pada perlakuan sublimat.
2. PEMBAHASAN
Jika ditinjau
dari kecepatan (waktu) kontaminasi, baik eksplan
dengan perlakuan
clorox maupun eksplan dengan perlakuan
sublimat, maka
kontaminasi tersebut dinamakan initial contaminant
karena
kontaminasi muncul beberapa hari setelah inokulasi. Initial
contaminant merupakan jenis
kontaminasi yang dapat disebabkan
karena materi
kultur (eksplan) yang berasal dari greenhouse atau
62
lapangan terlalu
kotor dan sterilisasi yang dilakukan kurang optimal.
Selain itu,
kontaminasi ini ditandai dengan munculnya kontaminan
beberapa hari
setelah inokulasi dimana pada percobaan ini
eksplan dengan
perlakuan clorox terkontaminasi pada HST 1 dan
eksplan dengan
perlakuan sublimat terkontaminasi pada HST 3.
George (2008)
mengemukakan bahwa kontaminan yang paling
sering, menyerang
eksplan adalah bakteri dan fungi. Respon
eksplan terhadap
bakteri adalah 2 x 24 jam, sedangkan respon
eksplan terhadap
fungi adalah 1 x 24 jam. Maka dapat dipastikan
bahwa
kontaminasi yang terjadi pada eksplan clorox disebabkan
oleh fungi
karena kontaminasi muncul pada HST 1. Walaupun
demikian
kontaminasi eksplan sublimat tidak dapat dikatakan
berasal dari
bakteri karena responnya lebih dari 1 x 24 jam. Hal ini
dikarenakan
penampakan morfologi kontaminan eksplan clorox
dan eksplan
sublimat tidak berbeda dimana pada permukaan
eksplan yang
terkontaminasi terdapat bulu-bulu halus berwarna
putih. Menurut
Irwanto (2006), bakteri yang mengkontaminasi
eksplan akan
membentuk gumpalan lumpur pada permukaan
medium dan
berwarna kuning atau orange. Sehingga diasumsikan
eksplan
sublimatpun terkontaminasi oleh fungi.
Kontaminasi
pertama pada semua eksplan terjadi di bagian ujung
eksplan lalu
menyebar ke seluruh permukaan eksplan. Hal
tersebut dapat
diindikasikan karena kurang optimalnya proses
penggosokan
bulu-bulu halus yang terdapat di permukaan eksplan
pada teknik
sterilisasi awal dimana bagian ujung eksplan tersebut
memiliki tekstur
yang relatif lebih lunak dibandingkan bagian
eksplan lainnya.
Sehingga penggosokan yang terlalu intens dapat
menyebabkan
kerusakan jaringan eksplan.
Hasil pengamatan
selama empat minggu menunjukkan bahwa
eksplan yang
direndam dalam larutan sublimat 1% memiliki daya
tahan yang lebih
tinggi terhadap kontaminan dibandingkan dengan
eksplan yang
direndam dalam larutan clorox 2%. Dari jumlah total
20 botol untuk
masing-masing jenis sterilan, enam eksplan yang
disterilkan
dengan sublimat mampu bertahan dari kontaminasi
sedangkan untuk
eksplan bebas kontaminan yang disterilisasi
dengan clorox
hanya berjumlah dua. Karena itulah eksplan yang
merupakan
tanaman berkayu seperti jati dianjurkan disterilisasi
63
menggunakan
sublimat. Hidayat (2005) menyebutkan bahwa
bahan
sterilisasi seperti clorox relatif belum efektif untuk
mensterilkan
eksplan tanaman berkayu seperti Surian (Toona
sinensis) jika
dibandingkan dengan sublimat meskipun konsentrasi
clorox yang
digunakan lebih tinggi daripada konsentrasi sublimat.
SUMBER
: Oleh:
Rudi
Hartono2
Balai
Besar Penelitian Bioteknologi dan Pemuliaan Tanaman Hutan
Jl.
Palagan tentara Pelajar Km. 15 Purwobinangun Pakem Sleman
Yogyakarta
( 0274 ) 895954 ; 896080 / Fax ( 0274 ) 896080;
E-mail
: breeding@biotifor.or.id
2E-mail
: die_no90@yahoo.com
Tidak ada komentar:
Posting Komentar